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Sun, Evan S. Krystofiak, … Bechara KacharRasmus P. Thomsen, Mette Galsgaard Malle, … Jørgen KjemsMarie Fuest, Miroslava Schaffer, … Thomas P. BurgNature Communications Band 13, Artikelnummer: 4985 (2022) Diesen Artikel zitierenDer parazelluläre Durchgang von Ionen und kleinen Molekülen durch Epithelien wird durch Tight Junctions kontrolliert, komplexe Netzwerke aus Claudin-Polymeren, die dichte Versiegelungen zwischen benachbarten Zellen bilden.Wie die nanoskalige Architektur von Tight-Junction-Netzwerken den parazellulären Durchgang spezifischer Ionen oder kleiner Moleküle ermöglicht, ohne die Barrierefunktion zu beeinträchtigen, ist unbekannt.Hier kombinieren wir superauflösende stimulierte Emission-Depletion-Mikroskopie in lebenden und fixierten Zellen und Geweben, multivariate Klassifizierung von superauflösenden Bildern und Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer, um die nanoskalige Organisation von Tight Junctions aufzudecken, die von Säugetier-Claudinen gebildet werden.Wir zeigen, dass nur eine Untergruppe von Claudinen sich zu charakteristischen homotypischen Netzwerken zusammenlagern kann, während durch mehrere Claudine gebildete enge Verbindungen Nanoskala-Organisationsprinzipien der Vermischung, Integration, Induktion, Segregation und des Ausschlusses von Stranganordnungen aufweisen.Interessanterweise sind kanalbildende Claudine räumlich von barrierebildenden Claudinen über Determinanten getrennt, die hauptsächlich in ihren extrazellulären Domänen kodiert sind, von denen auch bekannt ist, dass sie Mutationen beherbergen, die zu menschlichen Krankheiten führen.Die elektrophysiologische Analyse von Claudinen in Epithelzellen legt nahe, dass die nanoskalige Segregation verschiedener kanalbildender Claudine eine Barrierefunktion in Kombination mit einem spezifischen parazellulären Ionenfluss über Tight Junctions ermöglicht.Während der Entwicklung und Homöostase müssen Gewebe nicht nur den Durchgang kleiner Moleküle und Ionen durch transzelluläre Transportmechanismen streng kontrollieren, sondern auch über parazellulär lokalisierte Adhäsionskomplexe, einschließlich Tight Junctions (TJs)1.TJs bilden apikale Zell-Zell-Kontakte in Epithelien2 und beschränken den Durchgang von Krankheitserregern, kleinen Molekülen, Ionen und Wasser durch sehr enge parazelluläre Membrankontakte1.Claudine sind Transmembranproteine, die ~10 nm dicke Stränge bilden, die in TJ-Netze verwoben sind3 und sich intrazellulär mit zahlreichen Gerüstproteinen und dem Zytoskelett verbinden4.Diese Stränge können als parazelluläre Diffusionsbarrieren gegen kleine und große gelöste Stoffe wirken, z. B. wenn sie aus Barriere-Claudinen wie Claudin-1 (Cldn1)5,6 oder Cldn37 bestehen.Zusätzlich werden größen- und ladungsselektive Ionen/Wasser-Kanäle innerhalb der Stränge von Cldn28,9,10, Cldn10a/b11,12, Cldn1513,14,15 und Cldn1616,17 gebildet.Frühe elektrophysiologische Messungen, mathematische Modellierung18 sowie strukturelle und funktionelle Daten von Kanal- und Barriere-Claudinen19,20 führten zu einem Modell, in dem parazelluläre Poren, die von ausgewählten Claudinen gebildet werden, in TJ-Stränge integriert werden.Wie TJ-Netze aus einzelnen oder mehreren Claudinen im Nanomaßstab organisiert werden, um parazelluläre Barrieren- und Kanalfunktionen zu integrieren, ist jedoch unbekannt.Abgesehen von Aminosäuren, die eine parazelluläre Ladungsselektivität ermöglichen, hat der Vergleich der primären Proteinsequenzen von barriere- und kanalbildenden Claudinen keine charakteristischen Kanalmerkmale aufgedeckt, die ihre unterschiedliche Organisation erklären könnten21.Darüber hinaus zeigten Gefrierbruchelektronenmikroskopie(FFEM)-Bilder von endogenen oder rekonstituierten Claudinsträngen keine spezifischen ultrastrukturellen Merkmale von Barriere- und Kanalclaudinen14, möglicherweise aufgrund struktureller Effekte einer starken chemischen Fixierung, die für diese Analyse erforderlich ist2.Die superauflösende Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht jetzt die molekulare Bildgebung lebender Zellen und fixierter Gewebe mit Nanometerauflösung und wurde zur Visualisierung ausgewählter Claudine22,23,24 angewendet.Hier verwenden wir STED-Mikroskopie (Super-Resolution Stimulated Emission Depletion) in lebenden und fixierten Zellen und Geweben, um die nanoskalige TJ-Organisation aller 26 Claudine von Säugetieren aufzudecken.Wir stellen fest, dass nur die Hälfte der individuell exprimierten Claudine TJ-Stränge oder -Netzwerke selbst bilden, während TJs, die aus mehreren Claudinen gebildet werden, nanoskalige Organisationsprinzipien der Vermischung, Integration, Induktion, Segregation und des Ausschlusses von Stranganordnungen aufweisen.Die bemerkenswerte Segregation von kanal- und barrierebildenden Claudinen im Nanomaßstab innerhalb einzelner Stränge wird zumindest teilweise durch extrazelluläre Claudindomänen vermittelt, während die Assoziation von Claudin mit ZO-1-Adapterproteinen entbehrlich ist.Wir nehmen an, dass die Trennung von Kanal- und Barriere-Claudinen ein Schlüsselmechanismus für die ordnungsgemäße Claudinkanalfunktion ist, die bei bestimmten Patienten mit Claudin-Mißense-Mutationen (z. B. N48K)25 beeinträchtigt ist.Funktionelle Ionenpermeabilitätsmessungen von Claudinen, die in einer TJ-Strang-freien Epithelzelllinie reexprimiert wurden, zeigten, dass die Segregation den parallelen Fluss von entgegengesetzt geladenen Ionen ermöglicht und die Ionenspezifität erhöht.Unsere Daten zeigen, dass der parazelluläre Ionentransport durch segregierte TJ-Netze vermittelt wird.Diese Ergebnisse können weitreichende Auswirkungen auf die Zellphysiologie und unser Verständnis der Gewebebarrierefunktion haben.Claudine, die wichtigsten konstituierenden Proteine ​​von TJs, sind Tetraspan-Transmembranproteine ​​mit zwei extrazellulären Schleifen, die von 26 Genen bei Mäusen und 25 Genen beim Menschen kodiert werden.Sie bestimmen die parazellulären Barriere- und Flusseigenschaften von TJs, indem sie bis zu einem Mikrometer große Maschenwerke am apikalsten Teil der lateralen Membran von epithelialen Zell-zu-Zell-Kontakten bilden (Abb. 1a).Die superauflösende STED-Mikroskopie mit einer lateralen (XY) Auflösung von ~50 nm ermöglichte es uns, endogenes Cldn3 in TJs des Mausduodenums sichtbar zu machen, das mit spezifischen Antikörpern markiert war (Abb. 1c).Während Einzelstränge und enge Strangverbände unter 50 nm Abstand innerhalb des intestinalen TJ-Netzes nicht aufgelöst werden konnten, wurden große einzelne Maschen und die TJ-Gesamtdicke von ~500 nm sichtbar, was mit früheren Beobachtungen von FFEM26 übereinstimmt.Um die nanoskalige Organisation einzelner Claudine innerhalb von TJs zu charakterisieren und die Einschränkungen der Antikörpermarkierung zu überwinden, rekonstituierten wir TJ-Netze, die von einzelnen Claudinen (und ihren Isoformen) in COS-7-Zellen gebildet wurden, ei, nicht polarisierten Fibroblasten-ähnlichen Zellen, die aus Afrika isoliert wurden Grüne Affenniere (Abb. 1b).Diesen nicht-polarisierten Zellen fehlen endogene Tight Junctional-Transmembranproteine, einschließlich Claudine, aber sie können dennoch TJ-Netzwerke8 bilden, die mit ZO-123, einem wichtigen TJ-Gerüstprotein27, kolokalisieren, wenn Claudine exogen exprimiert werden.Cldn3 mit YFP-Tag, das in den flachen überlappenden Bereichen benachbarter COS-7-Zellen sichtbar gemacht wurde, bildete große Maschenwerke, die aus mehreren einzelnen Claudinsträngen und kleinen Maschen bestanden (Abb. 1d), die der Organisation von endogenem Cldn3 im Darmgewebe sehr ähnlich waren (Abb. 1c). .Ähnlich organisierte Netzwerke wurden durch nicht markiertes Cldn3 gebildet, das mit Anti-Cldn3-Antikörpern markiert war, und durch Maus-Cldn3, das entweder an seinem N- oder C-terminalen Ende mit einem YFP markiert war (ergänzende Abb. 1d).Darüber hinaus kolokalisierten TJ-ähnliche Maschenwerke, die von Cldn3 oder verwandten Claudinen (dh Cldn1, Cldn2, Cldn10a) gebildet wurden, im Allgemeinen mit ZO-1, das endogen in COS-7-Zellen exprimiert wurde, aber nur peripher mit Aktin (ergänzende Abb. 1a – c).Da die Maschenwerkmorphologie durch chemische Fixierung beeinflusst werden könnte (Ergänzende Abb. 1e), analysierten wir die nanoskalige Organisation von SNAP-Cldn3 in lebenden COS-7-Zellen.Live-STED-Bildgebung zeigte Strangdynamik, die Bildung großer Cldn3-Netze in lebenden Zellen und eine ähnliche Cldn3-Netzorganisation wie in mit 4 % PFA fixierten Zellen (Abb. 1e; ergänzende Abb. 1d; ergänzender Film 1).a Schema, das den endogenen TJ am apikalsten Zell-zu-Zell-Kontakt in Epithelzellen veranschaulicht.b Schema, das ein TJ-ähnliches Maschenwerk veranschaulicht, das in flachen überlappenden Bereichen von Claudin-transfizierten nicht-polarisierten Zellen gebildet wird.c, d Repräsentatives konfokales und STED-Bild eines endogen gebildeten, mit Cldn3 (2nd-Atto647N) markierten TJ zwischen Epithelzellen aus Gewebe des Maus-Zwölffingerdarms (c) und TJ-ähnlichem Netzwerk, gebildet durch überexprimiertes YFP-Cldn3 (α-GFP-NB- Atto647N) zwischen zwei COS-7-Zellen (d).e Repräsentative einfarbige STED-Zeitserie (1 Frame/10 s) eines TJ-ähnlichen Netzwerks in einer überlappenden Region lebender COS-7-Zellen, die SNAP-Cldn3 (BG-JF646) exprimieren.Weiße Pfeile zeigen den anfänglichen Strangbruch an, gefolgt von der Verschmelzung von zwei kleineren Maschen zu einer größeren Masche.Es wurde eine Gaußsche Unschärfe mit einem Sigma von 20 nm angewendet.f Full-Wide-Half-Maximum (FWHM)-Messung von TJ-Strängen von SNAP-Cldn3 (BG-JF646) in fixierten und lebenden COS-7-Zellen.Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD.Jeder Datenpunkt repräsentiert ein Linienprofil von insgesamt 160 Linienprofilen aus 8 unabhängigen TJ-ähnlichen Maschenwerken (n = 160).Die Gesamt-FWHM ergab 59 ± 11 nm für fixierte und 69 ± 14 nm für lebende Proben.Alle repräsentativen Bilder stammen aus 3 unabhängigen Experimenten.Maßstabsbalken, 1 µm (c, d) und 200 nm (Vergrößerungen in c, d und e).Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Einzelne Claudinstränge mit einer Dicke von ~10 nm können komplizierte Maschenwerke unterschiedlicher Morphologie bilden8,28.Um einzelne TJ-Stränge quantitativ zu charakterisieren, haben wir isolierte SNAP-Cldn3-Stränge in fixierten und lebenden COS-7-Zellen gemessen und charakteristische Breiten von 59 ± 11 nm bzw. 69 ± 14 nm gefunden (Abb. 1f).Der etwas größere Wert in lebenden Zellen könnte auf die Strangmobilität und/oder ein geringeres Signal-Rausch-Verhältnis im Zellkulturmedium im Vergleich zu fixiertem Zellmontagemedium zurückzuführen sein.Zu beachten ist, dass STED-Bilder im Allgemeinen ein geringeres Signal-Rausch-Verhältnis aufweisen als Bildgebungsverfahren, die zuvor zur Abbildung von Claudinsträngen verwendet wurden, einschließlich Weitfeld29, Konfokal29 und SIM23.Wir stellen fest, dass die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie von YFP-Cldn3 in fixierten HEK-Zellen24 ähnliche Strangbreiten ergab.Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die STED-Mikroskopie Maschen von Einzelsträngen in lebenden oder fixierten Zellen auflösen kann.Daher ist STED in der Lage, die molekulare Architektur von TJ-Anordnungen im Nanomaßstab in Zellen und Gewebe aufzudecken.Basierend auf diesen Ergebnissen und unter Ausnutzung der hervorragenden strukturellen Erhaltung chemisch fixierter Strangmorphologien analysierten wir alle 26 Claudine von Säugetieren, die an ihren N-Termini mit YFP markiert und mit Atto647N-markierten Anti-GFP-Nanobodies in fixierten COS-7-Zellen gefärbt wurden (Supplementary Abb. 2).Da die Hälfte der analysierten Claudine keine klaren Maschen bildeten, wollten wir die TJ-Strangformationen objektiv klassifizieren, basierend auf Texturmerkmalen der STED-Intensität30,31,32;das sind räumliche Intensitätsvariationen über eine Skala von 20–200 nm, wie im Methodenabschnitt erläutert.In der Tat bestätigte die hierarchische Clusterbildung von Strukturmerkmalen der Grundintensität unsere Trennung zwischen netzbildenden und nicht netzbildenden Claudinen weitgehend (ergänzende Abb. 2 und 3).Die meisten Claudine, die früher als klassische Claudine21 klassifiziert wurden, konnten zu TJ-Strängen polymerisieren;Ausnahmen waren Cldn4, Cldn8 und Cldn17.Wir bestätigten die meist gleichmäßige und unstrukturierte Verteilung von SNAP-Cldn4 oder SNAP-Cldn8 durch STED-Bildgebung lebender COS-7-Zellen (ergänzende Abb. 5i).Im Gegensatz dazu bildeten mit Ausnahme von Cldn11 und Cldn20 alle Claudine, die zuvor als nicht klassisch eingestuft wurden21,33, keine eigenen TJ-Stränge.Stattdessen erschienen sie entweder als gleichmäßig verteilte, kleine Punkte, unregelmäßige Cluster oder kleine Stränge.Cldn22 und Cldn27 teilweise in ER lokalisiert (ergänzende Abb. 2 und 3b, c).Claudine, die kein Maschenwerk bilden, müssen möglicherweise mit klassischen Claudinen oder anderen TJ-Proteinen zusammengebaut werden, um zu TJ-Anordnungen zu polymerisieren.Wir haben keine Korrelation zwischen der Fähigkeit beobachtet, Stränge mit Claudinen zu bilden, die entweder als Barriere oder als Kanal wirken (ergänzende Abb. 2 und 3).Claudine, die zuvor am Transport zweiwertiger Kationen beteiligt waren, wie Cldn1234,35 oder Cldn1616, waren unter diesen Bedingungen nicht in der Lage, nachweisbare Stränge und Netzwerke zu bilden (Ergänzende Abb. 2 und 3).Um die TJ-Netzbildung durch einzelne Claudine weiter zu klassifizieren, wurden STED-Bilder von netzbildenden Claudinen segmentiert und Merkmale der Netzmorphologie wie durchschnittliche Maschengröße, Verzweigungslänge und die Anzahl der Verzweigungen extrahiert und mit Intensitätstexturmerkmalen kombiniert (Abb. 2a ).Mittels hierarchischer Clusterbildung und Hauptkomponentenanalyse identifizierten wir drei Klassen von Maschenwerken: Claudine der Klasse A, bestehend aus Cldn7, Cldn10a (Anionenkanal), Cldn19a/b und Cldn20, bildeten große Maschenweiten.Zu den Claudinen der Klasse B gehörten Cldn2, Cldn10b, Cldn15, die Kationenkanäle bilden, sowie die barrierebildenden Cldn3, Cldn5 und Cldn14, und sie bildeten Maschen viel kleinerer Größe.Schließlich bauten sich Claudine der Klasse C wie Cldn1, Cldn6, Cldn9 und Cldn11 zu sehr dichten Netzstrukturen mit überwiegend parallelen Strängen zusammen (Abb. 2b; Ergänzende Abb. 4).In seltenen Fällen wurde beobachtet und gemessen, dass einzelne Stränge von Cldn11 eine ähnliche Breite wie Cldn3-Stränge hatten (ergänzende Abb. 3d; Abb. 1f).Interessanterweise ist bekannt, dass Claudine der Klasse C besonders dichte Versiegelungen in Epithelien bilden36, ein Merkmal, das bei exogener Expression in nicht-polarisierten COS-7-Zellen wiederholt zu werden scheint.a Hierachische Gruppierung aller in COS-7-Zellen exprimierten netzbildenden Säuger-Claudine in drei verschiedene Klassen unter Verwendung einer automatisierten Analyse auf der Grundlage von Haralick-Texturmerkmalen und Bildsegmentierung.Alle Claudine wurden N-terminal mit YFP oder GFP markiert und mit α-GFP-NB-Atto647N verstärkt.Die Spalten sind zentriert und die Einheitenvarianzskalierung wurde auf die Spalten angewendet.Der Korrelationsabstand mit der durchschnittlichen Verknüpfung wurde zum Clustern von Zeilen und Spalten verwendet.Bei den Haralick-Texturmerkmalen entspricht ein Pixel (px) 20 nm.Drei Klassen sind in Cyan (Klasse A), Gelb (Klasse B) und Magenta (Klasse C) gekennzeichnet.Claudine wurden nach ihrer Funktion farbcodiert, als Barriere (schwarz), Kationenkanal (grün), Anionenkanal (rot), Kationen- und Wasserkanal (blau) und heteromerer Ionenkanal, der von zwei verschiedenen Claudinen gebildet wird (orange).Der Farbcode der Heatmap stellt die Einheitsvarianzskalierung und die Anzahl der Standardabweichungen dar.Basierend auf einem Datensatz von 15 Claudinen mit insgesamt 202 Bildern.Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.b Repräsentative STED-Bilder von TJ-ähnlichen Netzwerken aus drei identifizierten Netzwerkklassen (A, B, C) in (a).ROIs wurden aus Zell-Zell-Überlappungen von zwei transfizierten Zellen entnommen.Alle Claudine wurden N-terminal mit YFP markiert und mit α-GFP-NB-Atto647N verstärkt.Maßstabsleiste, 200 nm (b).Zusammenfassend fanden wir heraus, dass nur etwa die Hälfte aller Säuger-Claudine in der Lage sind, Netzwerke zu bilden, und diese Fähigkeit scheint mit der Proteinsequenz-Homologie21,33, aber nicht mit der bisher bekannten Barriere-vs.-Kanal-Funktion zu korrelieren14.Dies deutet darauf hin, dass die Bildung von Maschenwerken ein intrinsisches Merkmal der Claudin-3D-Struktur und des Polymeraufbaus sein kann und Barriere- sowie Kanal-Claudine sich zu ähnlich organisierten Maschenwerken zusammensetzen können, die ihren Zusammenbau erleichtern können.TJ-Netze bestehen meistens aus mehreren barriere- und/oder kanalbildenden Claudinen36,37.Copolymere dieser Claudine können sich in unterschiedlichen Längenskalen bilden, die von gemischten Strängen bis zu kleinen getrennten Clustern oder größeren Segmenten innerhalb von Maschenwerken reichen, wodurch unterschiedliche lokale Ionenpermeabilitäten erzeugt werden, wie zuvor vorgeschlagen1,18,38 (Abb. 3a).Um die nanoskalige Organisation von Claudin-Copolymeren zu untersuchen, co-exprimierten wir Cldn3 oder Cldn4, zwei typische barrierebildende Claudine, die in den Atemwegen, Harnwegen und im Magen-Darm-Trakt vorkommen36, mit anderen Claudinen in COS-7-Zellen und analysierten überlappende Bereiche durch Zweifarben-STED-Mikroskopie (Abb. 3b; ergänzende Abb. 5a; ergänzende Abb. 6a).Bemerkenswerterweise wurden fünf verschiedene Arten von Verhaltensweisen von co-exprimierten Claudinen beobachtet: (i) Vermischen der barrierebildenden Cldn1, Cldn5, Cldn6, Cldn7, Cldn9, Cldn14 und Cldn19b mit Cldn3.(ii) Integration von Cldn4, einem Claudin, das nicht in der Lage ist, selbst TJ-Stränge zu bilden, in Cldn3-Stränge.(iii) Induktion von zusammengefügten Strängen und Maschenwerken aus zwei Claudinen, die kein Maschenwerk bilden, Cldn4 und Cldn8.(iv) Trennung von kanalbildenden Cldn2, Cldn10a, Cldn10b und Cldn15 von Cldn3 innerhalb einzelner TJ-Stränge und Maschenwerke, was zu abwechselnden Bereichen von kanalbildenden und barrierebildenden TJs führt.Schließlich (v) Ausschluss von Cldn3 und Cldn11 voneinander durch Bildung unabhängiger TJ-Netze.Diese fünf verschiedenen Arten der nanoskaligen Organisation von Claudin-Copolymeren wurden auch in der Maus-Fibroblasten-Zelllinie 3T3 und in COS-7-Zellen unter Verwendung eines GFP-Nanokörpers beobachtet, der mit einem hydrophileren Fluorophor markiert war (Ergänzende Abb. 7e, f).Ein Schema veranschaulicht vorhergesagte Claudin-Claudin-Organisationsmuster.Zwei Claudine (gelb und magenta), die miteinander kompatibel sind, kolokalisieren eng im TJ (rosa).Inkompatible Claudine trennen sich in verschiedene Stränge oder sogar größere Claudin-spezifische Teile.Diese Trennung könnte die Permeabilität spezifischer Ionen (Cyan) über das TJ-Netz erleichtern.b Repräsentative STED-Bilder des TJ-ähnlichen Netzwerks der beobachteten fünf Organisationsmuster, die durch die angegebenen co-exprimierten Claudine gebildet werden (SNAP-markiert (gelb; BG-Atto590) und YFP-markiert (magenta; α-GFP-NB-Atto647N)) in fixierten COS-7-Zellen sind gezeigt.Enge Kolokalisierung: Vermischung von netzbildenden Claudinen, Integration von nicht-netzbildenden mit netzbildenden Claudinen oder Induktion (de novo-Netzbildung von co-exprimierten nicht-netzbildenden Claudinen).Getrennte Claudins: Segregation und Ausschluss.c Pearson-Korrelationsanalyse von Cldn3, das mit barrierebildenden (grau) oder kanalbildenden (magenta) Claudinen koexprimiert wird.Als Positivkontrolle diente die Co-Expression von Cldn3 mit Cldn3 (gelb).Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD.Jedes n repräsentiert den Pearson eines TJ-ähnlichen Netzwerks.n(Cldn3 + Cldn3) = 55;n(Cldn3 + Cldn1) = 54;n(Cldn3 + Cldn5) = 20;n(Cldn3 + Cldn6) = 20;n(Cldn3 + Cldn7) = 17;n(Cldn3 + Cldn9) = 15;n(Cldn3 + Cldn14) = 19;n(Cldn3 + Cldn19b) = 25;n(Cldn3 + Cldn2) = 36;n(Cldn3 + Cldn10a) = 30;n(Cldn3 + Cldn10b) = 24;n(Cldn3 + Cldn15) = 42;aus 3–6 unabhängigen Experimenten;einfache ANOVA mit Dunnetts multiplem Vergleichstest;***P ≤ 0,001, ns (nicht signifikant).d Spektrale FRET-Analyse von Trq2-Cldn3 allein (leer; negative Kontrolle) oder co-exprimiert mit der angegebenen YFP-markierten Barriere Cldn3 (gelb; positive Kontrolle) und kanalbildendem Cldn2 oder Cldn15 (magenta) in HEK293-Zellen.Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD.Jedes n steht für einen Zell-Zell-Kontakt.n (Negativkontrolle) = 57, aus einem Experiment;n(Cldn3 + Cldn3) = 312;n(Cldn3 + Cldn2) = 162;n(Cldn3 + Cldn15) = 154;alle 4 bis 5 unabhängige Experimente;einfache ANOVA mit Dunnetts multiplem Vergleichstest;***P ≤ 0,001, ns (nicht signifikant).e Repräsentatives STED-Bild der Trennung von SNAP-Cldn3 (gelb; BG-JF646) und Halo-Cldn15 (magenta; CA-Atto590) in lebenden COS-7-Zellen.Bildrauschen wurde zur Visualisierung mit Noise2Void70 entfernt.f Repräsentative STED-Bilder der Vermischung und Segregation von SNAP-Cldn3 (gelb; BG-Atto590) mit YFP-markiertem Cldn1 und Cldn15 (beide magenta; α-GFP-NB-Atto647N), jeweils exprimiert in Caco-2-Zellen.g Repräsentative STED-Bilder des endogen gebildeten TJ in Kryoschnitten aus Mausduodenum, immungefärbt für Cldn3 (gelb; 2nd-Atto647N) und Cldn15 (magenta; 2nd-AF594).Weiße Pfeile zeigen Regionen im TJ an, die die Trennung von Cldn3- und Cldn15-Strängen zeigen.Es wurde eine Gaußsche Unschärfe mit einem Sigma von 20 nm angewendet.Alle repräsentativen Bilder stammen aus 3 unabhängigen Experimenten.Maßstabsbalken, 500 nm (g), 200 nm (b, e, f, Vergrößerung in g).Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Das Vermischungs-, Segregations- und Ausschlussverhalten der verschiedenen Claudine in Bezug auf Cldn3 wurde durch quantitative Kolokalisationsanalyse basierend auf der Pearson-Korrelation der Pixelintensität bestätigt, wobei positive Werte eine Vermischung und negative Werte eine Segregation oder einen Ausschluss anzeigen (Abb. 3c; ergänzende Abb. 5b–d).Diese Analyse ergab, dass die Vermischung von Cldn3 mit anderen barrierebildenden Claudinen nicht von einer Kolokalisation von Cldn3 mit sich selbst zu unterscheiden war.Im Gegensatz dazu waren kanalbildende Claudine wie Cldn2, Cldn10a, Cldn10b und Cldn15 innerhalb des TJ-ähnlichen Netzwerks fast vollständig von Cldn3 getrennt, was durch einen signifikant niedrigeren und manchmal sogar negativen Kolokalisierungsindex angezeigt wird (Abb. 3c).Ein ähnlich negativer Kolokalisierungsindex wurde für Cldn3 und Cldn11 beobachtet, die sich gegenseitig ausschließende TJ-Netze bildeten (ergänzende Abb. 5d).Um zu testen, ob diese Verhaltensweisen ein allgemeines Organisationsprinzip der TJ-Bildung durch Claudine widerspiegeln, haben wir das barrierebildende Cldn1 analysiert.Wir fanden heraus, dass sich Cldn1 mit Cldn3 vermischt, sich aber von den kanalbildenden Cldn2, Cldn10a, Cldn10b und Cldn15 trennt (ergänzende Abb. 5f).Um diese Ergebnisse durch einen alternativen Ansatz in Frage zu stellen, haben wir Claudin-Wechselwirkungen in lebenden Zellen auf einer molekularen Skala von ~10 nm durch Messungen des spektralen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfers (FRET) analysiert.Dies ermöglichte es uns auch, den möglichen Vorbehalt zu bewältigen, dass die beobachtete intermediäre Kolokalisation von Cldn3 mit einigen kanalbildenden Cldn2, einem parazellulären Natrium39- und Wasserkanal40, die begrenzte Auflösung der STED-Mikroskopie von ~50 nm widerspiegeln könnte.Ausgewählte Claudine mit Türkis- und YFP-Tag wurden in seitlichen Kontakten in menschlichen Epithelzellen (HEK293) sichtbar gemacht (Abb. 3d; ergänzende Abb. 5g).Wir fanden einen viel niedrigeren FRET für die heterotypische Cldn3-Cldn2-Wechselwirkung im Vergleich zu homotypischen Cldn3-Cldn3-Anordnungen, was frühere Studien bestätigte41.In HEK293- und COS-7-Zellen wurde kein FRET zwischen barrierebildendem Cldn3 und kanalbildendem Cldn15 beobachtet (Abb. 3d; ergänzende Abb. 7c).Integration, Induktion und Segregation konnten ferner durch STED-Bildgebung lebender Zellen in COS-7-Zellen beobachtet werden (Abb. 3e; ergänzende Abb. 5j), wodurch die Möglichkeit ausgeschlossen wurde, dass diese Organisationsprinzipien im Nanomaßstab Artefakte der chemischen Fixierung und Nanokörpermarkierung darstellen.Wichtig ist, dass endogenes Cldn3 und Cldn15, die im Darm stark exprimiert werden, wo Cldn15 einen parazellulären Na+-Kanal bildet, der erforderlich ist, um die Nährstoffaufnahme voranzutreiben42, bei exogener Expression von Cldn3 und Cldn15 in menschlichen Darm-Caco-2-Zellen ebenfalls getrennt wird (Abb. 3f; ergänzend Abb. 5e) und in Zwölffingerdarmgewebe der Maus (Abb. 3g; Ergänzende Abb. 5h).Wir spekulieren, dass die offensichtlichen Unterschiede in der Claudin-Netzwerkarchitektur zwischen nativem Gewebe und Zelllinien (Abb. 3b, e, f, g) auf Unterschiede in der Probenvorbereitung und TJ-Orientierung (kryoseziertes Gewebe vs. intakte lebende oder fixierte Zellen) zurückzuführen sein könnten. Nachfixierung durch Ethanol, Färbeverfahren (indirekte Immunfluoreszenz vs. genetisch codierte Marker) und/oder das Vorhandensein anderer TJ-Proteine ​​und zusätzlicher Zelladhäsionsstrukturen in Epithelzellen oder nativem Gewebe.Insgesamt scheint die Trennung zwischen barriere- und kanalbildenden Claudinen eher eine Protein-intrinsische Eigenschaft als eine Widerspiegelung des Zelltyps oder Gewebes zu sein.Diese Daten legen nahe, dass Claudine gemäß unterschiedlichen Organisationsprinzipien copolymerisieren, die die Trennung von barriere- und kanalbildenden Claudinen in Zellen und Geweben vorantreiben.Kanalbildende Claudine wie Cldn2, Cldn10a, Cldn10b und Cldn16 in Kombination mit Cldn19 sind in der Niere reichlich vorhanden und erleichtern die Resorption von Na+, Cl− und Mg2+10,16,43.Wir wollten daher wissen, ob Kanalclaudine sich nicht nur von der Barriere Cldn3, sondern auch voneinander trennen würden, möglicherweise um ihre einzigartigen Ionenkanaleigenschaften zu bewahren oder lokalisierte Ionenpermeabilitäten zu erzeugen.Als wir Cldn2, dh einen parazellulären Na+-Kanal, mit anderen kanalbildenden Claudinen wie dem Cl−-selektiven Cldn10a oder den Na+-selektiven Claudinen Cldn10b und Cldn15 oder mit der Barriere Cldn1 in COS-7-Zellen koexprimierten, beobachteten wir getrennte TJ-ähnliche Netze, wie durch ihren niedrigen Kolokalisierungsindex in STED-Analysen belegt (Abb. 4a, b; ergänzende Abb. 6b).FRET-Messungen in HEK293- und COS-7-Zellen bestätigten das beobachtete Fehlen einer Wechselwirkung zwischen Cldn2 und Cldn10a auf einer Skala unter 10 nm in lebenden Zellen (Abb. 4c; Ergänzende Abb. 7c).Eine Segregation von kanalbildendem Cldn2 und Cldn10a wurde auch in lebenden COS-7-Zellen gefunden, die durch Live-STED-Bildgebung (Abb. 4d) und in chemisch fixierten, nicht vollständig polarisierten Nierenepithelzellen (Abb. 4e, f) sichtbar gemacht wurden.ein repräsentatives STED-Bild eines TJ-ähnlichen Netzwerks, gebildet von SNAP-Cldn2 (gelb; BG-Atto590), co-exprimiert mit YFP-markiertem Cldn2, Cldn1, Cldn10a, Cldn10b und Cldn15 (alle magenta; α-GFP-NB-Atto647N) in COS-7-Zellen.b Pearson-Korrelationsanalyse von Cldn2, co-exprimiert mit Cldn2 (gelb), Cldn1 (grau) und Cldn10a, Cldn10b, Cldn15 (magenta).Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD.Jedes n repräsentiert den Pearson eines TJ-ähnlichen Netzwerks.n(Cldn2 + Cldn2) = 21;n(Cldn2 + Cldn1) = 29;n(Cldn2 + Cldn10a) = 35;n(Cldn2 + Cldn10b) = 28;n(Cldn2 + Cldn15) = 22;3 bis 5 unabhängige Experimente;einfache ANOVA mit Dunnetts multiplem Vergleichstest;***P ≤ 0,001, ns (nicht signifikant).c Spektrale FRET-Analyse von Trq2-Cldn2 (leer; Negativkontrolle) oder koexprimiert mit YFP-markiertem Cldn2 (gelb; Positivkontrolle) und Cldn10a (Magenta) in HEK-Zellen.Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD.Jedes n steht für einen Zell-Zell-Kontakt.n (Negativkontrolle) = 126, aus einem Experiment;n(Cldn2 + Cldn2) = 405;n(Cldn2 + Cldn10a) = 115;4 bis 10 unabhängige Experimente;einfache ANOVA mit Dunnetts multiplem Vergleichstest;***P ≤ 0,001, ns (nicht signifikant).d Repräsentatives STED-Bild der Trennung von SNAP-Cldn2 (gelb; BG-JF646) und Halo-Cldn10a (magenta; CA-Atto590) in lebenden COS-7-Zellen.Bildrauschen wurde zur Visualisierung mit Noise2Void70 entfernt.e Repräsentatives STED-Bild der Segregation von SNAP-Cldn2 (gelb; BG-Atto590) und YFP-Cldn10a (magenta; α-GFP-NB-Atto647N), lokalisiert in einer Überlappungsregion zweier transfizierter MDCKC7-Zellen.f Pearson-Korrelationsanalyse von Cldn2, koexprimiert mit Cldn2 (gelb) und Cldn10a (magenta) in MDCKC7.Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD.Jedes n repräsentiert den Pearson eines TJ-ähnlichen Netzwerks.n(Cldn2 + Cldn2) = 17;n(Cldn2 + Cldn10a) = 16;aus 3 unabhängigen Experimenten;Mann-Whitney-Test, zweiseitig;****P ≤ 0,0001.g Repräsentatives STED-Bild des TJ im proximalen Tubulus der Maus, immungefärbt für Cldn2 (gelb; 2nd-Atto647N) und Cldn10a (magenta; 2nd-AF594).Das weiße Rechteck zeigt den Bereich der Vergrößerung an.h Pearson-Korrelationsanalyse von Cldn2 und Cldn10a in drei proximalen Tubuli der Maus.Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD.Jedes n repräsentiert das Pearson-Bild eines STED-Bildes des tubulären TJ.n (Röhrchen I) = 9;n(Rohr II) = 12;n(Tubulus III) = 11;einfache ANOVA Tukey-Mehrfachvergleichstest;ns (nicht signifikant).i Stranglängenanalyse von Cldn2- und Cldn10a-Strängen in drei proximalen Tubuli (Tub I-III).Die Daten stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar;n = 4, Mittelwert der gemessenen Stränge für jeden Tubulus;Stränge Tubulus I: 541 (Cldn2)/664 (Cldn10a), Stränge Tubulus II: 747 (Cldn2)/791 (Cldn10a), Stränge Tubulus III: 693 (Cldn2)/828 (Cldn10a);einfache ANOVA mit Tukeys multiplem Vergleichstest;***P ≤ 0,001, ns (nicht signifikant).Alle repräsentativen Bilder stammen aus 3 unabhängigen Experimenten.Maßstabsbalken, 500 nm (g), 200 nm (a, d, e, Vergrößerung in g).Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.Im dicken aufsteigenden Ast der Henle-Schleife des Nephrons wird der parazelluläre Na+- und Mg2+-Fluss durch drei Claudine Cldn10b/16/19 vermittelt, die sich in einem Zell-Zell-Kontakt-spezifischen Mosaikmuster befinden43.Interessanterweise wurde bei exogener Koexpression von Cldn10b, Cldn16 und Cldn19a in COS-7-Zellen eine Kombination aus Integration, Segregation und Ausschluss beobachtet (ergänzende Abb. 7a, b).Die paarweise Koexpression von Cldn19a und Cldn16 erzeugte integrierende Netzwerke.Cldn19a und Cldn10b bildeten getrennte Maschenwerke, während durch Cldn16 und Clnd10b gebildete Maschenwerke voneinander ausgeschlossen waren.Als alle drei Claudine zusammen exprimiert wurden, wurde Cldn16 in Cldn19a-Stränge integriert, die von den aus Cldn10b bestehenden Strängen getrennt blieben (ergänzende Abb. 7a, b).Daher bleiben drei der grundlegenden nanoskaligen Organisationsprinzipien von Claudinen, dh Integration, Segregation und Exklusion, in einem rekonstituierten System erhalten und könnten zu einer räumlichen Trennung des parazellulären Na+- und Mg2+-Transports führen, der in TAL43 gefunden wird.Um festzustellen, ob die Organisationsprinzipien tatsächlich die nanoskalige Verteilung von Claudinen im Nephron bestimmen, haben wir den proximalen Tubulus von isolierten Maus-Nephronen gefärbt.Wie aus unserer Analyse von in COS-7-Zellen rekonstituierten Claudinen vorhergesagt, fanden wir eine alternierende Immunreaktivität für Cldn2 und Cldn10a in primären Maus-Nephronen, die einen geringen Kolokalisierungsgrad aufwiesen (Abb. 4g, h; ergänzende Abb. 7d).Abgesehen von ihrem Segregationsverhalten in proximalen Tubuli zeigten Cldn2 und Cldn10a eine beträchtliche Heterogenität in Bezug auf die Stranglänge zwischen verschiedenen Tubuli und sogar innerhalb desselben Tubulus ohne Hinweis auf eine Claudin- oder ortsspezifische Stranglänge (Abb. 4i).Wir schließen daraus, dass TJ-Netze, die von verschiedenen Claudinen gebildet werden, nicht nur zwischen barriere- und kanalbildenden Claudinen, sondern auch zwischen verschiedenen kanalbildenden Claudin-Isoformen getrennt sind, möglicherweise um den Ionenfluss im Nanomaßstab innerhalb von Zellen und Geweben räumlich zu beschränken.Als nächstes machten wir uns daran, die molekulare Basis der beobachteten Segregation verschiedener Kanalclaudine zu bestimmen.Da die Fähigkeit, segregierte Claudin-Netzwerke zu bilden, von relativen Proteinkopienzahlen abhängen kann, haben wir zuerst die Wirkung verschiedener Proteinexpressionsverhältnisse getestet.Kanalbildende Cldn2 und Cldn10a zeigten bei allen getesteten Expressionsverhältnissen eine Segregation mit geringer Kolokalisation, während die Stranglängen positiv mit den Expressionsniveaus korrelierten (Abb. 5a).a Repräsentative STED-Bilder, Immunoblot-Analyse, Stranglänge und Pearson-Korrelationsanalyse von TJ-ähnlichem Netzwerk, das aus SNAP-Cldn2 (gelb; BG-Atto590) und YFP-Cldn10a (Magenta; α-GFP-NB-Atto647N) mit unterschiedlicher Expression gebildet wird Verhältnisse (3:1, 1:3) in COS-7-Zellen.Blotting wurde gegen SNAP-Tag und YFP-Tag durchgeführt.Als Ladekontrolle diente HSP70 (70 kDa).Für die Strang- und Pearson-Analyse wurden die gleichen TJ-Meshworks verwendet.Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD.Für die Stranglängenanalyse repräsentiert jedes n den Mittelwert von 40 Strängen von Cldn2 und Cldn10a pro Maschenwerk aus 12 TJ-ähnlichen Maschenwerken (n = 12);einfache ANOVA Tukey-Mehrfachvergleichstest;***P ≤ 0,0001, **P ≤ 0,01, ns (nicht signifikant);aus 3 unabhängigen Experimenten;für die Pearson-Analyse repräsentiert jedes n ein TJ-ähnliches Netzwerk (n = 12);Mann-Whitney-Test, zweiseitig;ns (nicht signifikant) (P = 0,8623) aus 3 unabhängigen Experimenten.b Repräsentative STED-Bilder von Kontroll- und cholesterinarmen COS-7-Zellen, die SNAP-Cldn2 (gelb; BG-Atto590) und YFP-Cldn10a (magenta; α-GFP-NB-Atto647N) exprimieren.Weiße Pfeile zeigen auf Claudin-haltige Vesikel, die vermehrt unter Cholesterinverarmungsbedingungen gebildet wurden.Nat.Artikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google Scholarbiol.EUR.Artikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarProz.Wissenschaft.EUR.Artikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google Scholarbiol.Artikel CAS PubMed Google ScholarInt.Wissenschaft.Mol.biol.biol.Artikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarProz.Wissenschaft.Artikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarInt.Artikel CAS PubMed Google ScholarMol.biol.Artikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarProz.Wissenschaft.Wissenschaft.Artikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarMol.Artikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarProz.Wissenschaft.Artikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarChem.Artikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarChem.Artikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarNat.Kommun.Proz.Wissenschaft.Mol.Artikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarNat.Kommun.Kommun.biol.biol.Artikel CAS PubMed Google Scholarbiol.Artikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarNat.Kommun.Wissenschaft.Nat.Artikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarTechnik.Artikel CAS PubMed PubMed CentralGoogle ScholarSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenSie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchenDie Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.